В. И. Фурсов, В. М. Инюшин
Кафедра дарвинизма и генетики Казахского государственного университета,
Цитология, Т. 4
Алма-Ата, 1962 г. 

В современной литературе существует довольно противоречивые данные о наличии ДНК в неоплодотворенных яйцеклетках. Цитохимические исследования показывают, что в кариоплазме яиц многих животных, относящихся к различным систематическим группам, ДНК на ранних этапах развития не обнаруживается. Подробная сводка по этому вопросу дана в работе П. В. Макарова (1958), монографии Браше (1960) и др. Ануклеальность ядер неоплодотворенных яйцеклеток описана у ряда цветковых растений: гороха, клевера, различных видов пшениц, ржи и др. (Модилевский, 1953; Васильева, 1954; Петрова, 1958; Фурсов, 1960, 1961, и др.). П. В. Макаров (1958), резюмируя вопрос о содержании ДНК в яйцеклетках ряда животных и растений, отмечает, что в этих объектах ДНК не могла быть выявлена ни одним из применявшихся методов: реакцией Фельгена, окраской метиловым зеленым, абсорбцией ультрафиолетовых лучей с длиной волны 280 ммк.

Однако, несмотря на это, многие исследователи считают, что ДНК в неоплодотворенных яйцеклетках содержится (Hoff-Iorgensen and Zeuthen, 1952; Hoff-Iorgensen, 1954; Роскин и Левинсон, 1957, и др.). По их мнению, ДНК в кариоплазме яйцеклеток находится в состоянии большой дисперсности и в относительно малых количествах, поэтому яйцеклетки являются фельген-отрицательными.

Браше (1960) отмечает, что достоверность данных по содержанию ДНК в неоплодотворенных яйцах, очевидно, целиком зависит от специфичности метода ее определения и характера строения яиц. «В крупных яйцах правильное определение следов ДНК в присутствии огромных количеств резервного материала – задача огромной трудности» (Браше, 1960, стр. 204).

За последнее время широкое применение в цитохимических исследованиях нашла люминесцентная микроскопия. Работами М. Н. Мейселя (1955) и его последователей (Михайлов и Дьяков, 1961, и др.) установлено, что люминесцентный микроскоп дает возможность определения нуклеиновых кислот даже и в том случае, когда их не удается выявить с помощью красителей.

Нуклеиновые кислоты обладают свойством интенсивно соединяться с акридиновыми красителями (Snapper et al., 1947; Goesner, 1949; Kurnic, 1950; Stich, 1951). В опытах in vitro было установлено, что комплексы акридинового оранжевого с различными нуклеиновыми кислотами флуоресцируют разным светом (Мейсель и Корчагин, 1952). ДНК флуоресцирует зеленым, а РНК – красным светом. Это открытие легло в основу целого ряда микробиологических и цитологических исследований с помощью люминесцентной микроскопии и дало весьма обнадеживающие результаты по изучению локализации нуклеиновых кислот в живых и переживающих клетках (Мейсель, 1955; Bartalanffy and Bickis, 1956; Armstrong and Niven, 1957; Austin and Bishop, 1959, и др.).

В настоящей работе освещаются результаты исследований по локализации нуклеиновых кислот в клетках зародышевого мешка пшеницы, полученные гистохимическими методами и с помощью люминесцентной микроскопии.

Объектами исследований служили неопыленные и опыленные пестики различных сортов твердых и мягких пшениц: Гордеиформе 189, Мелянопус 3199/41350, Казахстанская 126 и озимый сорт Кооператорка. Для гистохимических исследований пестики фиксировались в жидкости Карнуа. Для исследования с помощью люминесцентного микроскопа помимо фиксированного материала использовались срезы из свежезамороженного материала и живые объекты. Срезы фиксированного материала, толщиной 18 мк, изготовлялись с помощью обычного микротома. Замороженные срезы, толщиной 10-15 мк, получались на замораживающем микротоме с ножом глубокого охлаждения. Для обнаружения нуклеиновых кислот гистохимическими методами были использованы реакция Фельгена и окраска метиловым зеленым – пиронином по Браше.

При люминесцентных исследованиях срезы фиксированного материала после освобождения от парафина, окрашивались акридиновым оранжевым. Свежезамороженные срезы помещались в изотонический раствор поваренной соли. Прижизненная окраска и исследование объектов также производились в изотоническом растворе. Окраска срезов производилась акридиновым оранжевым в концентрации 1:10 000. Фиксированные объекты красились 3-4 мин., живые – 10-15 мин.

Специфичность флуоресценции РНК проверялась с помощью контрольных препаратов, которые перед окрашиванием флуорохромами обрабатывались рибонуклеазой при температуре 60° в течение 2 часов. На контрольных препаратах свойственная РНК ярко-красная флуоресценция в цитоплазме и ядрышках не наблюдалась. Исследование фиксированных срезов производилось в 20%-м сахарном сиропе по методу Шалумовича (1959) или в такой же концентрации поливинилового спирта. Раствор поливинилового спирта при застывании равномерно пропитывает объект, образуя тонкую пленку, и тем самым дает возможность получить тотальный препарат.

В наших исследования люминисцентная микроскопия производилась в падающем свете по системе Брумберга (1953). Источником ультрафиолетового света служила лампа ДРШ-250. Ультрафиолетовая часть спектра в области 380 ммк выделялась фильтром УФС – 3 и отражалась интерференционной пластинкой. Флуоресценция изучалась визуально, а также регистрировалась при помощи обычной и цветной микрофотографии.

В ядрах яйцеклеток, синергид и полярных ядрах сформированного зародышевого мешка ДНК не обнаруживалась ни с помощью реакции Фельгена, ни при окраске метиловым зеленым. В момент двойного оплодотворения, которое наступает у пшениц в условиях юго-востока Казахстана через 1-1,5 часа после опыления, кариоплазма яйцеклетки и полярные ядра остаются еще ануклеальными. Интенсивно красятся по Фельгену и метиловым зеленым только спермии, находящиеся в этот момент в яйцеклетке и в одном из полярных ядер зародышевого мешка.

Содержание ДНК в ядре зиготы и в первичном ядре эндосперма начинает обнаруживаться с помощью окрасок только с момента их первого деления. Деление зиготы у пшениц начинается не раньше, чем через 15-16 часов после опыления и оплодотворения. Первичное ядро эндосперма делиться значительно раньше – через 3-4 часа после его образования.

Иные результаты были получены с помощью люминесцентной микроскопии. Характерное для ДНК свечение было обнаружено в ядрах неоплодотворенных яйцеклеток и в полярных ядрах зародышевого мешка изучаемых сортов пшениц. Необходимо отметить, что наиболее интенсивное свечение дают живые объекты. В фиксированных объектах, вследствие сжатия и коагуляции структур протоплазмы, флуоресценция нуклеиновых кислот менее ярко выражена.

В неоплодотворенном женском гаметофите пшеницы кариоплазма яйцеклетки и полярных ядер дает желто-зеленую флуоресценцию. РНК цитоплазмы флуоресцирует красным цветом. Ярко оранжевую флуоресценцию имеют ядрышки в ядрах. Вокруг ядрышек видна небольшая кольцевая зона наиболее интенсивного желто-зеленого свечения. Аналогичное свечение наблюдали Аустин и Бишоп (Austin and Bishop, 1959) на живых неоплодотворенных яйцах крысы.

Однако флуоресценция ядра яйцеклетки и полярных ядер зародышевого мешка, в отличие от ядер антипод и ядер окружающих клеток семяпочки, проявляется гораздо слабее и имеет диффузный характер. Последнее обстоятельство дает основание полагать, что в неоплодотворенной яйцеклетке и полярных ядрах зародышевого мешка пшениц агрегатное состояние ДНК иное, чем в ядрах соматических клеток.

Резюме

С помощью люминесцентной микроскопии было обнаружено наличие ДНК в ядре неоплодотворенной яйцеклетки и в полярных ядрах зародышевого мешка у ряда сортов твердых и мягких пшениц.

Литература 

  1. Браше Ж. 1960. Биохимическая цитология.
  2. Брумберг Е. М. 1953. Применения интерференционных делительных зеркал в флуоресцентных микроскопах. Ж. общ. Биол., 14, 6: 461-464.
  3. Васильева О. А. 1954. Цитоэмбриологические исследования множественного оплодотворения у гороха. Изв. АН СССР, сер. Биол., 2: 49-73.
  4. Макаров П. В. 1958. Новые данные о строении и свойствах клеточного ядра. Архив анат. Гистол. Эмбриол., 35, 6: 16-18.
  5. Мейсель М. Н. 1955. Люминесцентная микроскопия и ее применение в цито- и гистофизиологии. В кн.: Современные методы и техника морфологических исследований, М.: 73-80.
  6. Мейсель М. Н. и Корчагин В. Б. 1952. Люминесцентно-микроскопическое выявление нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов. Бюлл. Экспер. Биол. Мед., 33, 3: 49-52.
  7. Михайлов И. Ф. и Дьяков С. И. 1961. Люминесцентная микроскопия.
  8. М. Модилевский Я. С. 1953. Эмбриология покрытосемянных растений. Киев.
  9. Петрова К. А. 1958. Развитие зародышевого мешка многолетней пшеницы. В кн.: Отдаленная гибридизация в семействе злаковых, М.: 115-120.
  10. Роскин Г. И. и Левинсон Л. Б. 1957. Микроскопическая техника.
  11. М. Фурсов В. И. 1960. Онтогенез женского гаметофита цветка пшеницы. Докл. Каз. Акад. С/х наук, 2: 30-40.
  12. Фурсов В. И. 1961. Некоторые цитохимические данные полового процесса и эмбриогенеза пшениц. Науч. Докл. Мин. Сельск.хоз. каз. ССР, 2: 17-25.
  13. Шалумович В. П. 1959. Среда для заключения флуорохромированных гистологических срезов. Арх. Анат. Гистол. Эмбриол., 36, 2: 79-80.
  14. Armstrong I. and Niven I. 1957. Fluorescence microscopy in the study of nucleic acids. Histochemical observation on cellular and virus nucleic acids. Nature, 180, 4598: 1335.
  15. Austin C. and Bichop M. 1959. Differential fluorescence in living rat eggs trated with acridine orange. Exper. Cell. Res., 17, 1: 35.
  16. Bertalanffy L. and Bickis I. 1956. Identification of cytoplasmic basophilia – ribonucleic acid, by fluorescence microscopy. J. histochem. Cytochem., 4: 481.
  17. Goesner W. 1949. Zur Histochemic des Strugger-Effects. Verh. Drch. Ges. Pathol., 33: 204.
  18. Hoff-lorgensen E. 1954. Цит. По: Браше, 1960.
  19. Kurnic N. 1950. Methyl green – pyronin. Basis of selective staining of nucleic acid. J. gen. physiol., 33, 3: 243.
  20. Stich H. 1951. Tripaflavin und Ribonucleinsaure. Untersucht an Mausgeweben, Condylostema spec. und Acctabularia mediteranea. Naturwissenschaften, 28, 18: 435.
  21. Snapper I., Mirsky A., Ris H., Schneid B. and Rosenthal M. 1947. Development of inclusion bodies containing ribose nucleic acidimyeloma cell after injection of stilbamidine. Elood., 2, 4: 311.